PERCOBAAN
V KROMATOGRAFI KOLOM
JUDUL PRAKTIKUM : KROMATOGRAFI KOLOM
1. Latar Belakang
1.1
Definisi Kromatografi
Kolom
Menurut Gritter (1991: 91) kromatografi kolom
merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi
kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak
berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah
silika gel G-60, kieselgur, Al2O3,
dan diaion.
Menurut Yazid (2005: 98) kromatografi kolom
adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan
komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang
dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair,
ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya
adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan
dalam pemisahan senyawa-senyawa organik dan konstituen-konstituen yang sukar
menguap sedangkan untuk pemisahan jenis logam-logam atau senyawa anorganik
jarang dipakai.
Menurut
Hendayana (2006: 2-3) metode pemisahan kromatografi kolom ini adalah suatu
metode yang memerlukan bahan kimia yang
cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom
gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom
diperlukan waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu
campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar
mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang
tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir
fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel
yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga
tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam
bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat
digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi
fasa diam.
Berdasarkan beberapa pendapat diatas maka
dapat disimpulkan bahwa kromatografi kolom merupakan suatu teknik pemurnian komponen dari suatu
campurannya dengan menggunakan alat yang dinamakan sebagai kolom. Dalam
kolom terjadi proses pemisahan campuran yang berkolaborasi dengan fase diam dan
fase gerak. Fase diam pada kromatografi kolom dapat berupa silika gel sedangkan
fase geraknya dapat berupa pelarut yang
bersifar polar, non polar maupun semipolar.
1.2 Mengapa Perlu Dilakukannya Metode Kromatografi
Kolom?
Metode
kromatografi kolom digunakan untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari
campurannya. Dimana metode ini biasanya sering digunakan untuk aplikasi
preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram. Kemudahan pembuangan fase diam
ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fase diam akibat pemakaian ulang. Kromatografi
kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan
berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi
sampel terelusi melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut
dengan kromatogram.
1.3 Penelitian
Terdahulu Tentang Kromatografi
Kolom
Penelitian lainnya yang berkaitan dengan
percobaan ini juga telah dilakukan oleh Sayekti
(2013:133) “Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi
Kolom Tekan”. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi rhodinol dari minyak sereh Jawa menggunakan metode
kromatografi kolom tekan (KKT) dengan menggunakan komposisi eluen toluen : etil
asetat secara bergradien. Selanjutnya hasil pemisahan diidentifikasi dengan
spektrofotometer IR dan spektrofotometer GC-MS. Metode yang dilakukan pada percobaan
ini adalah dengan menggunakan kromatografi kolom tekan.
Tahap
pertama disiapkan kolom dengan tinggi 30 cm yang berdiameter 2 cm lalu
dimasukkan silika gel 60 (230 – 400 mesh yang terlebih dahulu direndam
toluen) dengan tinggi 20 cm. Sebanyak 5 mL
sampel yang telah dilarutkan dalam 3 mL toluen dimasukkan ke dalam kolom yang
telah diisi silika dan dielusi menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat
bergradien. Komposisi eluen yang digunakan adalah toluen 100% dan toluen : etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5
dan
12:0,7. Tetes eluat ditampung tiap 5 mL/vial pada 5 botol vial
pertama dan 3 mL/vial untuk vial berikutnya sehingga diperoleh beberapa fraksi.
Setiap fraksi diuji dengan KLT dengan komposisi eluen yaitu toluen : etil asetat (12:0,1) lalu
disemprot dengan larutan vanilin sebagai penampak noda dan dipanaskan. Setiap
noda yang sama digabungkan dan dilakukan KLT kembali. Setelah dua kali
pemisahan melalui kolom tekan, isolat dengan noda utama (mayor) dan terpisah
dengan baik. Hasil KKT menggunakan komposisi eluen toluen : etil asetat
(12:0,1) (analisis KLT menggunakan plat silika gel; tebal 0,25 mm; jarak elusi
4 cm; penampak noda vanilin; dipanaskan) diperoleh 233 fraksi.
Penelitian lain juga dilakukan oleh Sari
(2015) dalam jurnal “Fraksinasi dan
Identifikasi Senyawa Antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona
muricata L.) secara Kromatografi Kolom”. Pada penelitian
ini akan dilakukan fraksinasi ekstrak etanolik daun sirsak dengan metode
kromatografi kolom. Daun
sirsak dicuci bersih dan dikeringkan dengan diangin-anginkan, kemudian digiling
sampai terbentuk serbuk simplisia. Satu kg serbuk dimaserasi selama 1 hari
terlebih dahulu dengan pelarut etanol 96%. Selanjutnya serbuk dipindahkan ke
dalam perkolator sampai didapat ekstrak cair. Ekstrak etanol daun sirsak
dipekatkan dengan menggunakan pemanas diatas water bath pada suhu 50°C sampai
didapatkan ekstrak kental. Ekstrak
kental kemudian dilakukan standardisasi ekstrak dan dilakukan pemilihan fase
gerak menggunakan beragam jenis (n-heksan, kloroform, etil asetat dan etanol)
dan komposisi (1:9 ; 5:5 ; 9:1) eluen. Fase gerak yang terpilih digunakan pada
kromatografi kolom.
Pada
hasil pemeriksaan organoleptis didapatkan warna hijau kehitaman dengan bentuk
ekstrak kental. Pada pemeriksaan kadar air diperoleh hasil 6,26%. Hal ini
sesuai dengan batas persyaratan yaitu kurang dari 10% (DirJen POM RI, 2000).
Pemeriksaan kadar air ini bertujuan untuk mengetahui besarnya kandungan air
dalam ekstrak etanol. Pada penetapan kadar abu ekstrak diperoleh hasil 5,78%.
Penetapan ini ber-tujuan untuk mengetahui gambaran kandungan mineral yang
berasal dari simplisia kering sampai terbentuknya ekstrak. Dari beberapa
variasi fase gerak yang dicobakan, didapatkan hasil bahwa kloroform : etil
asetat merupakan fase gerak terpilih yang dapat memberikan keterpisahan noda
yang banyak dan memberikan spektrum daya antioksidan yang paling luas. Eluen
yang terpilih tersebut akan digunakan untuk fraksinasi dengan metode
kromatografi kolom.
Selanjutnya penelitian secara kromatografi
kolom juga dilakukan oleh Hayani (2007) dalam jurnal “Pemisahan Komponen
Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom”. Pemisahan komponen rimpang
temu kunci secara kromatografi kolom bertujuan untuk mengetahui
komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa
aktifnya. Untuk pengisian kolom, sebagai bahan pengisi bagian bawah kolom
dimasukkan sedikit kapas, wol kaca dan pasir laut kemudian dimasukkan bubur
silica gel 70-230 mesh sambil diaduk agar tidak terdapat rongga udara di
tengahtengah kolom. Timbunan bubur silica gel dalam kolom mencapai tiga
perempat tinggi kolom.
Untuk pemisahan komponen dengan menggunakan
kromatografi kolom, mula-mula ke dalam kromatografi kolom dialirkan ekstrak
rimpang temu kunci, kemudian kran kromatografi kolom dibuka. Ekstrak
akan meresap ke silica gel dalam kolom sampai batas atas silika gel. Setelah
itu dimasukkan pereaksi terus-menerus sambil kran kolom dibuka. Fraksi yang terpisah ditampung dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml sampai seluruh
ekstrak terpisahkan. Dari hasil
analisis mutu simplisia temu kunci diperoleh kadar sari yang terlarut dalam air
4,35%, lebih besar dibanding kadar sari yang terlarut dalam alkohol (2,24%).
Hal ini menunjukkan simplisia temu kunci mudah larut dalam air. Kadar abu
sangat kecil yaitu 0,41%, yang menunjukkan bahwa simplisia temu kunci sangat
sedikit tercemar bahan asing seperti pasir.
2.
TUJUAN PERCOBAAN
Adapun tujuan dari kromatografi kolom yaitu
pemisahan komponen campuran zat berdasarkan afinitas terhadap komponen zat
terhadap fasa diam (zat penyerap).
3.
TINJAUAN
PUSTAKA
1.1.
Silika Gel
Kurk Silika gel adalah substansi-substansi yang
digunakan untuk menyerap kelembaban dan cairan partikel dari ruang yang
berudara/bersuhu. Silika gel juga membantu menahan kerusakan pada barang-barang
yang mau disimpan. Silika gel lebih sering digunakan dibandingkan activated carbon untuk beberapa
senyawaan, seperti:
· Senyawaan polar, akan lebih mudah didesorpsi dari silica gel dibandingkan
charcoal.
· Senyawaan amina, senyawaan nitro dan beberapa senyawaan anorganik (contoh ;
Acid mist) tidak dapat dikumpulkan pada charcoal.
Salah satu kelemahan utama silica gel adalah
higroskopis (mudah menyerap air). Silika gel mempunyai afinitas yang tinggi
terhadap air. Jika pengambilan sampel dilakukan pada atmosfer yang lembab, maka
uap air akan diadsorpsi pada silica gel, sehingga mengurangi kapasitas
adsorpsinya. Bahkan apabila kelembapan sangat tinggi, dan karena air memiliki
polaritas yang tinggi dapat menggantikan senyawaan yang kurang polar yang telah
teradsorpsi pada silica gel, sehingga hasil pengukuran menjadi berbeda
(Lestari, 2010).
1.2. Prinsip Kromatografi Kolom
Prinsip metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak
sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk
melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu
yang cukup lama, bisa berjam-jam hanya
untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan
pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih
dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa
gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang
cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relatif kecil sehingga tempat
untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam
bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat
digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi
fasa diam (Hendayana, 2006: 2-3).
Untuk memisahkan campuran, kolom yang telah
dipilih sesuai campuran diisi dengan bahan penyerap seperti alumina dalam
keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan
bantuan batang pengaduk untuk memanfaatkan adsorben dan gelas wool pada dasar
kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata
sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas
biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok.
Sejumlah cuplikan yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas
kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam
campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa
pita sempit pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara
terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan
pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap,
komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap apabila suatu
komponen yang satu dengan yang lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan
waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan (Yazid, 2005:
200-201).
4.
ALAT
DAN BAHAN
4.1. ALAT
No
|
Nama Alat
|
Ukuran
|
Jumlah
|
Gambar
|
|||
1
|
Timbangan
|
-
|
1
|
||||
2
|
Gelas
ukur
|
25
mL
|
1
|
||||
3
|
Kolom
kromatografi
|
-
|
1
|
||||
4
|
Gelas
kimia
|
100
mL
|
1
|
||||
6
|
Batang
pengaduk
|
15
cm
|
1
|
||||
7
|
Spatula
|
15
cm
|
1
|
||||
8
|
Pipet
tetes
|
-
|
1
|
||||
9
|
Kaca
arloji
|
-
|
1
|
4.2. BAHAN
No
|
Nama Bahan
|
Ukuran
|
Gambar
|
|||
1
|
Silikon
oksida
|
20
gram
|
||||
2
|
1-Butanol
|
20
mL
|
||||
3
|
KMnO4
|
2,5 mL
|
||||
4
|
K2Cr2O7
|
2,5 mL
|
||||
5
|
Aqua dm
|
100 mL
|
5.
PROSEDUR KERJA DAN PENGAMATAN
No
|
Prosedur Kerja
|
Pengamatan
|
Reaksi
|
|||
1
|
Ke dalam kolom yang bersih, dimasukkan penyerap silika gel yang dibasahi dengan air (menjadi
larutan kental) setinggi 10 cm.
|
-
|
||||
2
|
Ditambahkan pelarut
1-butanol (eluen) hingga mencapai 1 cm diatas permukaan penyerap (jaga agar penyerap jangan sampai kering).
|
|
-
|
|||
3
|
Dimasukkan 5 ml
sampel (campuran larutan KMnO4 dan larutan K2Cr2O7).
|
-
|
||||
4
|
Dimasukkan fase diam
dan fase gerak kedalam kolom. Sehingga terjadi proses fraksinasi.
|
-
|
6. PEMBAHASAN
Percobaan ini dilakukan dengan metode kromatografi kolom, untuk
memisahkan campuran larutan antara kalium permanganat dan larutan kalium
dikromat yang telah dihomogenkan. Fase diam yang digunakan adalah silika gel
sedangkan fase gerak yang digunakan adalah pelarut 1-butanol. Silika
gel digunakan sebagai fase diam karena silika gel memiliki pori-pori dan tidak
mudah bereaksi dengan senyawa-senyawa organik pada kolom. Pelarut 1-butanol merupakan senyawa organik polar, Dicampurkan larutan KMnO4 dan K2Cr2O7
kedalam gelas kimia maka dihasilkan larutan berwarna merah darah. Lalu
dimasukkan larutan tersebut kedalam kolom yang sudah berisi silika gel. Sampel tersebut membutuhkan waktu lama untuk
menuruni kolom (proses fraksinasi lama), tetapi ketika ditambahkan 1-butanol
komponen-komponen sampel sangat cepat menuruni kolom. Hal
ini terjadi karena perbedaan kepolaran antara 1-butanol dan sampel yang
dianalisis, dimana 1-butanol lebih polar daripada sampel sehingga 1-butanol
mempunyai kemampuan berikatan lebih besar dengan sampel. Ini berarti sampel
harus diserap secara
kuat pada silika gel dibandingkan dengan 1-butanol sehingga 1-butanol lebih
dahulu menuruni kolom. Hasil yang diperoleh pada percobaan ini berupa 3 fraksi.
Fraksi pertama merupakan larutan tidak bewarna, kedua larutan bewarna kuning
dan ketiga larutan berwarna ungu.
Hasil percobaan diatas sesuai dengan teori yang
menyatakan bahwa pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan
waktu yang cukup lama, bisa berjam-jam
hanya untuk memisahkan satu campuran (Hendayana, 2006:2-3). Kemudian hasil ini juga sesuai dengan
penelitian yang telah dilakukan oleh Endah Sayekti, Ajuk Sapar, Titin Anita
Zaharah dan
Fitririyanti (2013:133) “Isolasi Rhodinol dari Minyak Sereh Jawa
Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan”. Kromatografi kolom terbagi dua, yaitu kromatografi fasa normal
dan kromatografi fasa terbalik, percobaan ini menggunakan kromatografi fasa
terbalik. Kromatografi fasa terbalik yaitu adsorben yang digunakan bersifat
nonpolar, sedangkan eluennya bersifat polar dan sampel juga bersifat polar. Silika
gel yang merupakan adsorben bersifat nonpolar,
sedangkan 1-butanol sebagai eluen dan KMnO4 dan K2Cr2O7
sebagai sampel bersifat polar. Hal ini sesuai dengan metode yang digunakan pada percobaan ini kromatografi
kolom dengan fasa diam silika gel yang bersifat
nonpolar dan fasa gerak yaitu toluen 100% dan toluen : etil asetat = 12:0,1 ; 12:0,5 dan 12:0,7 yang bersifat polar. Sehingga pada kedua
percobaan ini menghasilkan beberapa fraksi. Fraksi awal yang akan keluar merupakan
senyawa nonpolar kemudian diikuti dengan senyawa yang bersifat semipolar dan
selanjutnya senyawa bersifat polar.
7. PENUTUP
7.1. Kesimpulan
Berdasarkan
hasil percobaan terjadi pemisahan senyawa KMnO4 dan senyawa K2Cr2O7
berdasarkan afinitas terhadap senyawa tersebut dengan fase diam berupa silika
gel dan fase gerak berupa pelarut 1-butanol diperoleh 3 fraksi yaitu larutan
1-butanol, larutan kalium dikromat, dan kalium permanganat. Metode ini dapat memisahkan antara senyawa yang polar dan
nonpolar. Senyawa yang non polar akan lebih cepat keluar dari keran kolom
daripada senyawa yang polar.
7.2.
Saran
· Praktikan harus membasahi silika gel yang sudah dimasukkan kedalam kolom,
agar kolom tidak retak atau pecah.
· Diharapkan
untuk menggunakan pelarut eter dan metanol dengan perbandingan 1:1 dan etanol dan
kloroform dengan perbandingan 1:1.
· Gunakanlah fase diam berupa
aluminium oksida.
· Pengisian bahan penyerap harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat
mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk
membantu homogenitas biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok.
8.
DAFTAR
PUSTAKA
Diyan
Maya Sari, Sumi Wijaya, Henry Kurnia Setiawan. 2015. Fraksinasi dan
Identifikasi Senyawa antioksidan pada Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona
muricata L.) secara Kromatografi Kolom. Jurnal Farmasi Sains Dan Terapan, Vol. 2, No. 2.
Endah
Sayekti, Ajuk Sapar, Fitririyanti, Titin Anita Zaharah. 2013. Isolasi Rhodinol
dari Minyak Sereh Jawa Menggunakan Metode Kromatografi Kolom Tekan. Semirata,
Vol, 2. No, 1.
Eni
Hayani. 2007. Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom. Buletin
Teknik Pertanian, Vol. 12 No. 1.
Gandjar,
Ibnu Gholib dan Abdul Rohma., 2007. Kimia
Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka pelajar.
Hendayana,
Sumar. 2006. Kimia Pemisahan.
Bandung: Remaja Rosdakarya.
Roy
J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: ITB.
Yazid,
Estien. 2005. Kimia Fisika Paramedis.
Yogyakarta: Andi.